AmeliaLane,KatarinaJovanovic,CiaraShortall,DanieleOttaviani,AnnaBrugulatPanes,ViewORCIDProfileArpadPalfi,NaomiChadderton,G.JaneFarrar,AlisonJ.Hardcastle,ViewORCIDProfileMichaelE.Cheetham
摘要
RP2中的突变导致X连锁性视网膜色素变性（XLRP）的严重形式。RP2充当小GTPaseARL3的GTPase活化蛋白（GAP），这对于纤毛功能以及感光器的发育和维持至关重要。人们对RP2相关的视网膜变性的机制了解甚少，并且RP2XLRP的基因工程动物模型具有不同的视网膜表型和缓慢的变性，表明了潜在的物种差异。在这里，我们开发了CRISPR基因编辑的等基因RP2敲除（RP2KO）诱导的多能干细胞（iPSC）和RP2患者衍生的iPSC，以产生3D视网膜类器官作为人类视网膜疾病的模型。等基因的RP2KO视网膜类器官和两个不相关的RP2患者iPSC系产生的视网膜类动物具有定义的感光细胞层（ONL），其中包含杆和锥感光细胞。令人惊讶的是，RP2KO和RP2患者衍生的类器官在培养天（D）时显示出ONL变薄，这与分化D时ONL中细胞死亡的激增有关。在此阶段，RNA测序证实了RP2无效类器官中细胞死亡途径的诱导。光感受器细胞死亡和ONL变薄归因于经历末端杆状细胞分化的细胞，其特征在于RHO表达降低和视紫红质免疫反应性光感受器更少。在AAV2/5载体中使用人RP2转基因进行基因扩增可有效转导RP2KO类器官，并导致杆和视锥细胞中RP2的高水平表达。重要的是，病毒转导显着增加了ONL厚度并恢复了视紫红质的表达，表明RP2变性表型得以挽救。这些数据表明，3D视网膜类器官可用于模拟与遗传性视网膜疾病，感光细胞死亡相关的分子缺陷，也可用于测试旨在预防感光细胞变性的潜在疗法。
介绍
将患者衍生细胞重编程为诱导性多能干细胞（iPSC），可以衍生和分化多种体细胞类型，并彻底改变了我们研究遗传性疾病的能力（Takahashi等，）。近年来，随着生成三维视网膜类器官的协议的完善，iPSC向视网膜谱系的分化取得了巨大进步（Nakano等人，；Zhong等人，）。与以前的2D模型不同，这些3D结构包含具有形态可识别特征的感光体。包括线粒体丰富的内部节段，具有连接纤毛的基本外部节段以及除双极，Müller胶质细胞，神经节和无长突细胞外的突触椎弓根，突触层和外部限制膜，它们排列在视网膜层中（参见（Castro等。，，Capowskietal。，）。这些先进的模型已被证明具有许多翻译研究应用，包括移植研究（Pearsonetal。，，Gonzalez-Corderoetal。，），探讨视网膜发育的机制。（Phillips等人，），以及特定的视网膜疾病建模和测试人类感光细胞中潜在疗法的功效（Parfitt等人，；Deng等人，；Schwarz等人，；Sharma等人。，年，Quinn等人，年）。然而，迄今为止，它们尚未用于建模和挽救光感受器细胞死亡。
RP2突变约占所有X连锁性视网膜色素变性（XLRP）的15％（Hardcastle等，；Breuer等，）。RP2是小型GTPaseARL3的GTPase活化蛋白（GAP）（Veltel等，），也受鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF）ARL13B的调节（Gotthardt等，）。ARL13B位于睫状轴突，而RP2和ARL3则位于基体，而相关的中心体位于光感受器的基部（Grayson等，；Evans等，）。ARL3及其效应子（UNC和PDEdelta（PRBP））和GAPRP2被认为在视网膜中将脂转导蛋白，让GRK1和PDE6等脂化蛋白关键性的转运到感光器外部（Zhangetal。，），Schwarz等人，；Zhang等人，；Wright等人，；Ismail等人，）。与人类疾病相比，RP2基因敲除小鼠具有相对较轻的表型。在一个模型中，在14个月时就出现了GRK1和视锥细胞PDE6a的错误定位/缺失（Zhang等人，），而另一种模型据报道在2个月时视紫红质和M视蛋白的定位不正确，而在5个月时ONL变薄了。（Li等，）。相反，人类表型相对较严重，一些患者在童年时期经历了黄斑萎缩（Jayasundera等人，），突显了人类视网膜疾病模型的必要性。
当前没有针对这种情况的疗法，因此需要开发潜在的疗法。iPSC衍生的RPE和早期在RP2中无意义突变的个体的早期视网膜类器官的特征（c.CT，p.RX）显示了高尔基凝聚力，RPE中的Gbeta转运和视网膜类器官中Kif7的睫状转运（Schwarz等人，年，Schwarz等人，年）。此外，通读药物G和/或Ataluren（PTC）的治疗可以恢复可检测的全长RP2蛋白，并挽救iPSC-RPE中高尔基体的内聚力和Gbeta错定位以及视网膜类器官中的驱动蛋白运输。研究表明，在动物体内进行玻璃体内注射（IVT）或视网膜下注射后，使用腺相关病毒（AAV）对其他遗传性视网膜疾病进行基因治疗可有效地转导感光细胞和RPE（Allocca等，；Sarra等，）。动物模型。目前有FDA和EMA批准的AAV介导的眼基因疗法（Russell等人，），并且许多AAV介导的眼基因疗法目前处于I/II和III期临床试验中（综述见（Trapani和Auricchio，）（clinicaltrials.gov）。将人RP2的AAV递送至RP2-XLRP的小鼠基因敲除模型可以保持视锥细胞功能，但对杆细胞功能没有影响，并且在较高病毒剂量下观察到毒性（Mookherjee等，）。
在这里，我们描述了CRISPR基因编辑的RP2敲除视网膜类器官相对于它们的同基因控制的时间成熟度，以及来自两个具有相同RX无意义突变的无关个体的视网膜类器官。这些研究表明，RP2的缺失导致棒状感光细胞变性，可以通过AAV递送RP2来挽救。
结果
淘汰RP2和RP2患者iPSC发育成熟的视网膜类器官
来自两个无关的个体（RX-A和RX-B）的成纤维细胞携带无意义突变c.CT；通过Yamanaka因子的核转染和游离表达将p.RX重编程为iPSC（Okita等，；Schwarz等，）。CRISPR-Cas9带有设计为靶向RP2外显子2的向导，用于通过同时重编程和基因编辑方案生成RP2基因敲除iPSC（Howden等人，）。选择gRNA在外显子2上的位置是因为它靠近c.CTp.RX位点，因此生成的任何敲除品系都将紧密模拟这种无意义的突变的后果。RP2KOiPSC克隆是通过非同源末端连接（NEHJ）介导的插入缺失创建的。选择了一个在RP2外显子2中缺失8bp的克隆（RP2c._delAAGCTGGA；p.LysSerfsTer11）进行进一步研究，因为它在提前终止密码子之前具有最短的移码扩展。iPSC的Western印迹显示出有效的敲除，因为未检测到RP2蛋白（图1A，B）。
图1。
来自RX，RP2KO和等基因对照iPSC的视网膜类器官。
A.编辑的RP2KOiPSC的Sanger序列跟踪。CRISPR-Cas9基因编辑被用于通过NEHJ在RP2外显子2中产生8bp缺失。
B.对照和RP2KOiPSC的蛋白质印迹和免疫细胞化学（ICC）。
C.在D处的视网膜类器官形态，DIC在透明ONL上方可见IS/OS层。
D.D视网膜类器官的ICC。对照和RP2无效的iPSC视网膜类器官的ONL中的光感受器（recoverin和锥Arr），外膜（OLM，F肌动蛋白）线粒体（Tom20）和连接纤毛/OS（GT）表达。RP2在对照类器官的ONL和INL中的细胞质膜表达。比例尺=10μm
E.在D（n＝3）在整个视网膜类器官中的RP2mRNA的qPCR。
F.D标度的对照和RP2KO视网膜类动物的电子显微照片=5μm（左），1μm（右）。
RP2KO品系，未经编辑的等基因对照和两个RX患者iPSC品系使用前述方法在4-10个月内分化为视网膜类器官（RO）（Zhong等，，Nakano等，），并稍加修改。两种方法均产生了生物学上相似的类器官，它们在测试时间点上在发育和结构上均具有可比性。在第天（D），通过光学显微镜可以看到带有刷状边框的透明ONL（图1C）。首先可以在D的回收蛋白阳性ONL的对照类器官中检测到视紫红质阳性细胞的散布，然后随着RO的成熟直至D的数量随时间增加（图S1A）。到D为止，所有细胞系都能够产生视网膜类器官（ROs），该类器官由层压结构组成，该层压结构具有一个压缩的外核层（ONL），其中包含恢复素和视锥蛋白抑制蛋白阳性感光体（图1D），位于一个内核层（INL）之上。PKCα阳性双极细胞和CRALBP/Nestin阳性Müller胶质细胞（图S1B）。在所有类器官中，ONL终止于顶端边缘，其外部限制膜（OLM）对F肌动蛋白具有强免疫反应性（图1D）。在OLM上方，线粒体（对TOM20具有免疫反应性）富含球状内部区段（IS）。睫状标记物ARL13B和聚谷氨酰微管蛋白（GT）的免疫染色显示，在连接纤毛的感光器尖端，鼓起的形状逐渐成熟，形成了从D开始的外段（OS）状结构（图S1C）。RP2可以在内外核层中所有细胞的质膜的对照RO中检测到。在RP2KO和RX细胞系中，尽管在推测的OS边缘观察到一些背景荧光，但免疫细胞化学（ICC）却没有RP2免疫反应性。使用qPCR测量D处RO中相对RP2mRNA的表达。RP2KO克隆相对于其同基因对照仅具有20％RP2mRNA，类似于RX患者ROs（n=3）（图1E），这表明突变体等位基因转录物在所有这些ROs中均受无义介导的降解作用。电镜检查证实在根尖睫状尖端存在紊乱的膜状盘，这让人想起对照和RP2KOROs中早期的OS形成（图1F）。通常发现它们与RO的主体分离，表明在没有RPE的情况下这些结构的柔性或脆性。这些结果表明，RP2切除不会延迟或阻止iPSC分化为3DRO培养中带有OS结构的感光体。
RP2的丢失导致感光细胞死亡和ONL变薄
与体内的神经视网膜相似，RO的最外层细胞层由均匀的致密ONL组成，该ONL以感光突触椎弓根终止，该突触椎弓根通过对突触结构蛋白Bassoon具有免疫反应性的层与内部视网膜细胞隔开（图2A）。体内ONL中感光核数目的减少以及由此厚度的减少是感光细胞变性的标志。对DRXRO的观察表明，它们的ONL可能比对照RO薄。因此，在等基因对照和RP2KO在D，D和D处测量了ONL厚度（图2B）。在对照RO中，平均ONL厚度在D和D之间从20μm增加到25μm，然后在D和D之间没有明显变化。相反，在RP2KO视网膜类器官中，平均ONL厚度在D和D之间显着降低（p=0.02）。同样，与对照细胞系相比，两名患者的RXRO在D时的ONL明显更薄（p≤0.01；图2，图S2）。这表明在RP2无效细胞系中D和D之间可能发生光感受器细胞死亡。
图2。
感光受体分化与RP2KO类器官中的细胞死亡相关
A.对照和RP2KO视网膜类器官的ICC显示RP2KO中ONL厚度降低。Recoverin染色划定了ONL终止于用巴松管染色的突触层（比例=10μm）。B.从冷冻切片在D，D和D处测量每个类器官的平均ONL厚度。在RP2KO（n=9类器官）和RX系（n=3RXA，n=9RXB）中的D处记录到明显的ONL稀疏，但在对照（n=10）中p≤0.01则没有。C.ONL中的TUNEL反应核（箭头）定量为D处总DAPI核的百分比。规模=10μmD。TUNEL反应性的定量。RP2KO类器官在Dn=5p≤0.05时具有较高的TUNEL阳性细胞比例，但在D或D处则没有。RX类器官在D处的TUNEL反应性也增加。E.来自RO的RNAseq数据的主成分分析。F.样品到样品之间的距离。G.维恩图显示RP2KO与对照和RX与对照和常见基因之间差异表达的基因H.热图显示DE基因簇的上调（蓝色较低表达，黄色较高表达）I.DE基因簇的下调的热图。J.KEGG上调基因的途径分析。下调基因的KKEGG通路分析。
为了进一步检验该假设，我们测量了RP2KO和对照RO在D，D和D处ONL的TUNEL反应性（图2C，D）。在所有时间点，在感光器ONL中都可以检测到少量的TUNEL阳性核。在对照RO中，TUNEL反应性在D，D或D处没有显着差异。而RP2KORO在D时ONL的TUNEL阳性细胞明显增加。在D或D处，RP2KO与对照之间没有显着差异，这表明在缺乏RP2的细胞系中，在D附近的感光细胞分化和成熟过程中，细胞死亡达到峰值。这在RX-ARO中得到了证实，因为D处的TUNEL反应性有所增加，而D已解决了这一问题（图2D）。这些数据表明，感光细胞死亡出现一个峰值，这与其成熟以及视紫红质表达增加的时间相吻合。
与RP2缺失相关的基因表达变化
为了研究可能与RP2无效类器官中的感光细胞死亡相关的基因表达变化，对D对照，RP2-KO和RX-AROs进行了RNAseq。主成分分析（PCA）和样品到样品的距离表明，RP2KORO的基因表达谱与RX-A患者谱系比亲本同基因对照更为相似（图2E，F），表明存在丢失的影响RP2功能。此外，与对照相比，RP2KO和RXRO之间共有个共享的差异表达（DE）基因（图2G-1）。对DE基因的KEGG通路分析表明，主要的上调途径是“p53信号传导途径”，而主要的下调途径是“轴突指导”（图2J，K）。对KEGG细胞凋亡和p53信号通路的进一步研究表明，在两个RP2无效RO中，许多促凋亡基因（例如p21，BAX和PUMA）均被上调（图S3），支持观察到RP2缺失会诱导细胞死亡。在RO中。
杆状感光细胞的分化和存活受到RP2KO和RX视网膜类器官的损害
为了确定哪种类型的感光细胞受RP2的损失影响最大，在视锥细胞和视锥细胞的D处用视紫红质和视锥细胞抑制素对杆和视锥细胞染色（图3A）。令人惊讶的是，与同基因对照相比，RP2KORO中视紫红质的免疫反应性降低。与在RP2KORO中广泛分布的恢复蛋白表达不同，视紫红质只限于ONL的斑块。为了评估光感受器基因的表达，我们通过qPCR定量了视紫红质（RHO）和棒转导蛋白（GNAT1）的表达。在对照中，RHO和GNAT1均显示出年龄依赖性的增加，在D和D之间显着增加。相反，RP2KOROs在D处RHO和GNAT1mRNA的表达降低，但在D或D处却没有，表明从D以后开始出现这种差异。对视紫红质具有免疫反应性的光感受器的百分比被量化为所有RO的切片中ONL全长上DAPI阳性核的百分比（图3C）。对照显示随着RO的成熟，视紫红质阳性细胞增加。尽管各个RO之间存在差异，但在同基因对照和RP2KO细胞系之间，成熟RO中的视紫红质表达细胞百分比（D）存在显着差异（图3A，C）。此外，两条RX品系在D处也显示出很少的视紫红质阳性感光体，与RP2KORO相似（图3C）。对照和RP2KORO之间的双极细胞数（Chx10/PKCα）没有显着差异（图S4）。为了排除这些差异可能仅归因于细胞系之间成熟速率的延迟，将对照和RP2KO视网膜类器官在培养至D时再维持天。相对于D的对照RO，RP2KO的视紫红质阳性细胞更少，而恢复蛋白阳性的感光细胞得以维持（图3E）。
图3。
减少了RP2KO和RX患者视网膜类器官中杆状细胞的数量
A.视网膜类器官的ICC。对照中D，RP2KO和RXRP2视网膜类器官的ONL中低（上图）和高（下图）放大的恢复蛋白，视紫红质和视锥蛋白的免疫反应性。比例尺=50μm和10μm
B.视网膜类器官中的RHO和GNAT1水平。qPCR显示在D，D和D处，对照组和RP2KO视网膜类器官中mRNA的相对倍数变化（n=3、3、4）。
C.视分化的D-D，对照，RP2KO和RX患者细胞系中视紫红质阳性细胞的百分比。每个数据点代表1个类器官，其计数来自整个类器官切片（**p≤0.01）。
D.用回收蛋白和视紫红质染色的D分化对照和RP2KO类器官的高和低放大倍数（比例尺=10μm上图，μm下图）。
AAV2/5有效地转导视网膜类器官，以增加RP2空感光器中的RP2表达
AAV能够在视网膜下或玻璃体内注射后（Sarra等，）和iPSC衍生的ROs中的杆和锥感光器转导小鼠后有丝分裂的杆和视锥（Gonzalez-Cordero等，）。，Tornabene等人，年）。为了评估AAV将RP2传递到缺陷型感光细胞的能力，在观察到ONL变薄之前，在D用AAV2/5.CAGp.RP2（图4A）转导RP2KORO，并在D收获。在D，ICC可以在整个ONL中检测到RP2蛋白（图4B）。在较高的放大倍数下，在感光器的质膜上检测到RP2信号（图4C）。RP2阳性细胞的百分比是通过在与该细胞形态匹配的质膜上对紧邻的RP2信号进行核计数来确定的。ONL的转导效率为90±7％（图4D）。这包括视紫红质阳性的杆状细胞（图4E）和视锥细胞阻滞蛋白阳性的视锥细胞（图4E）。在视网膜内层中也可以看到零星的RP2染色，这表明一定比例的AAV能够穿透RO并转导视网膜内细胞（图S5）。通过qPCR对mRNA水平的分析显示，相对于对照类器官，RP2转录本平均增加了55倍（图4F）。
图4。
AAV2/5RP2可有效转导杆状和锥状光感受器
A.AAV结构示意图。CAG启动子（蓝色，CMV增强子，鸡b肌动蛋白启动子，CBA内含子）；RP2CDS（绿色）；RP23’UTR（蓝绿色）；pA（红色，最小的兔b球蛋白polyA）；ITR（组织）。
B.转导后RP2在RP2KO视网膜类器官中的表达。用AAV2/5CAGRP2转导后6周，RP2KO视网膜类器官冰冻切片的ICC显示跨整个感光层（ONL）的RP2表达。比例尺=50μm
C.RP2免疫反应性的高倍放大。比例尺=10μm
D.ONL和INL中具有RP2免疫反应性的细胞对DAPI评分（平均值=90±7％ONL对3±0.4％INL，n=3）。
E.ICC将RP2与视锥细胞抑制蛋白或视紫红质共染色，显示杆和视锥细胞感光细胞中AAV驱动的RP2表达。比例尺=10μm
F.相对于对照类器官中的内源性表达，AAV转导的RP2KO类器官中的RP2mRNA转录水平的qPCR（平均值=55倍±7.7SEM，n=3）。
AAV2/5驱动的RP2基因扩增提高了感光细胞的存活率
为了研究RP2水平的增加是否改变了ROs的变性表型，比较了D时转导的RP2AAV与未转导的RP2KOROs的ONL厚度和视紫红质免疫反应性（图5A，C）。用恢复蛋白对ONL进行染色，并用大管虫染色定界（图5A）。ONL的测量表明，在D处，AAV-RP2转导的RP2KO类器官比未转导的对照具有明显更厚的ONL（p≤0.01，图5B）。转导后的ONL厚度与D等基因对照细胞所观察到的相似，表明几乎完全可以挽救。在大多数但不是全部的类器官中，视紫红质阳性细胞的百分比高于未转导的RP2KOs的平均值，表明AAVRP2表达可以恢复视紫红质的免疫反应性（图5D）。在mRNA水平上也观察到了这一点，转导的RO中RHO水平最多增加了3倍；然而，一个转导的RO在视紫红质表达水平上没有反应（图5E）。
图5。
AAV2/5驱动的RP2过表达可挽救感光细胞的存活
A.RP2KO对照和AAV视网膜类器官ONL的ICC的恢复蛋白（绿色）和巴松管（红色），AAVRP2处理的视网膜类动物的ICC在AAV治疗组中显示出改善的ONL厚度。比例尺=10μm
B.对照和AAV转导的视网膜类器官中的ONL厚度的定量（n＝6个类器官，**p≤0.01）。虚线表示等基因对照亲本细胞系中的平均厚度。
C.ICC显示转导后RP2（绿色）和视紫红质（红色）的表达。比例尺=50μm
D.ICC的定量以评估对照和RP2AAV转导的RP2KO视网膜类器官视紫红质阳性。虚线表示平均控制值（n=6个类有机物，p=0.14，p=0.）。
D.对照和RP2AAV处理的RP2KO视网膜类器官（n=3）中RHOmRNA水平的qPCR。
讨论区
在这里，我们描述了RP2XLRP的体外模型，并表明RP2的AAV基因扩增可以成功逆转可测量的和临床相关的疾病表型。iPSC重编程，CRISPR基因编辑技术和AAV基因传递的结合，使RP2KO同基因对照和XLRP患者RO并排比较，从而消除了iPSC衍生的类器官模型的某些固有变化。
iPSC的分化提供了一个机会来探索受特定遗传变化影响的细胞和组织中的遗传疾病机制。在普遍表达的基因（例如RP2）的疾病病理仅限于特定组织（例如视网膜）的情况下，这特别有用。自年Sasai实验室进行的开创性研究以来，诱导iPSC分化为视网膜谱系的技术取得了巨大进步，该研究通过三维悬浮培养从小鼠ES细胞中产生“光杯”，然后在人类ES中进行概括。iPSC（Nakano等人，，Eiraku等人，，Zhong等人，）。在这里，我们将iPSC重编程技术与CRISPR/Cas9基因编辑结合使用来探测RP2XLRP中的疾病机制。
本研究中使用的所有RP2缺陷型细胞系均成功开发出具有先进形态学特征的3DRO，包括层压入内核和外核层，形成富含肌动蛋白的外部限制膜，具有线粒体的IS和OS且含有膜质的线粒体和杆状感光体光盘（尽管杂乱无章，没有堆叠）。令人惊讶的是，在所有RP2缺陷型细胞分化天后，我们观察到感光细胞数量（特别是视紫红质阳性棒）显着下降，ONL显着变薄。与体内发育时间一致，视紫红质的广泛表达是反渗透发展的后期事件之一。然而，RP2KO和患者细胞系（例如PKCα阳性双极细胞，OS结构）中存在其他新近出现的细胞标志物，以及这种视紫红质缺陷表型的持续存在长达天的分化表明，这不仅仅是一种发育迟缓的情况。
在任何现有的RP2XLRP动物模型中均未报告该表型（Li等人，；Zhang等人，），这表明该表型要么对人的视网膜特异，要么对体外类器官系统特异。尽管ROs与离体视网膜外植体培养相比可以保持14天左右的相对稳定性（JohnsonandMartin，），但培养中视网膜细胞维持的条件可能不是最理想的。例如，缺乏相对的RPE单层，缺乏血管血液供应而导致营养和氧气缺乏或视网膜内神经元缺乏连通性，可能是加速疾病表型发作的压力来源。这可能会解释体内相对于小鼠和人类RP2XLRP的可检测变化的早期“年龄”。在RP2KO小鼠中，一个模型仅在5个月大时才可检测到ONL变薄（Li等，），而另一种模型在12个月大时几乎未观察到ONL变薄（Zhang等，）。。在这里，我们检测到了杆分化和视紫红质表达开始时感光器存活的可测量差异。细胞死亡是视网膜发育过程中重要的非病理过程（Vecino等，），但在分化为RP2缺陷型ROs的感光细胞层期间似乎会增加，这在时间上将杆的成熟与杆状细胞的死亡联系在一起。有趣的是，来自RPGR突变（XLRP的另一种主要形式）的个体的ROs在RO分化约天时也显示出光感受器细胞死亡的迹象，这是通过CRISPR介导的iPSCRPGR突变修复得以挽救的（邓等，）。在RPGR视网膜类器官模型中也观察到了p53途径的诱导（Deng等人，），这表明这可能是人类ROs两种XLRP形式中的常见途径。因此，对于某些形式的IRD，光感受器细胞死亡似乎是RO的特征。
AAV是一种将治疗基因传递到感光细胞的高效方法，并且针对单基因遗传性视网膜营养不良的几项基于AAV的基因治疗试验正在进行中（综述参见（Trapani和Auricchio，））。已显示AAV2/5可在多种物种中有效转导光感受器，尤其是小鼠（Palfi等人，），非人类灵长类动物（Boye等人，）和人类视网膜外植体（Wiley等人，），Quinn等人，）。目前在人类RO中使用AAV相对有限，但是研究报告了不同的转导效率，这可能归因于治疗年龄，收获时间，载体嗜性，病毒滴度，使用的启动子和检测ASF的敏感性。转基因，例如抗体对报道分子的固有荧光的影响（Gonzalez-Cordero等人，，Tornabene等人，，Quinn等人，，Khabou等人，）。在这里，我们证明了在CAG启动子的控制下使用带有RP2的AAV2/5载体进行高效转导。尽管使用了普遍存在的启动子，但AAV似乎或多或少地仅将RP2递送至感光细胞。这可能是由于矢量趋向性和类器官的组织相结合所致，其中感光层位于最外层，因此第一个细胞与溶液中的病毒颗粒接触，类似于视网膜下递送后的情况。AAVRP2在光感受器TUNEL反应性增加和ONL变薄开始之前于D交付，但由于报道在较早时间点转导效率低下，已经足够晚以确保有效摄取（Gonzalez-Cordero等人，）。RP2不仅在mRNA和蛋白水平上得到有效表达，而且还能够挽救RP2KO视网膜类器官中的ONL稀疏表型，这暗示了RP2在感光细胞中过表达的保护作用。有趣的是，尽管RP2在内源性水平表达超过55倍，但我们没有观察到任何明显的有害作用。在最近的一项研究中，虽然最高剂量的AAV-RP2载体（1e9病毒基因组（vg）/眼）给药后3个月，小鼠的RP2过表达观察到一些毒性，尽管转导的RP2过表达水平小鼠的眼睛未定义（Mookherjee等人，）。由于RP2是ARL3的GAP，因此将RP2升高至较高水平可能会抑制ARL3-GTP的产生，并模仿造成Joubert综合征的ARL3GEF，ARL13b的损失。但是，由于蛋白质之间的空间分离，这种情况可能不会在细胞中发生，其中RP2主要位于纤毛的底部，而轴突中的ARL13b则导致纤毛中的ARL3-GTP发生梯度。尽管RP2含量很高，但是一旦将ARL3运载到纤毛中，它就可以被ARL13b转换为ARL3-GTP。但是，这不能将过表达的RP2的其他活性排除在稳态之外。因此，在转译至临床之前，评估RO和/或灵长类动物眼中AAV-RP2疗法的治疗指标的其他研究将很有价值。
尽管RP2在多种视网膜细胞类型中表达，但要最佳拯救RP2疾病表型的是否可能不仅需要在感光细胞中，而是还需要在其他视网膜细胞类型中表达替代的RP2基因，这些仍有待确定。RPE。原则上，在当前研究中使用普遍存在的启动子应该能够使治疗基因在多种细胞类型中表达。RP2连接的XLRP的临床表现可能有所不同，一些受影响的个体表现出RPE和脉络膜的脉络膜样色素沉着（Jayasundera等人，）。最近，据报道，尽管黄斑中有一些RPE丢失，但具有新的无效RP2变异的受严重影响的个体没有独立的RPE参与（Horner等人，）。然而，很明显，将需要进行其他研究来充分阐明RPE中对RP2的要求，从而指导RP2基因治疗的最佳设计。与目前的研究相反，Mookherjee等人。（）使用光感受器特异性视紫红质激酶启动子来驱动RP2基因的表达，并且使用这种特异性启动子在无效的RP2小鼠模型之一中实现了锥体表型的部分拯救，但是对杆表型没有有益作用。在需要转基因表达或在多种细胞类型中表达的情况下，值得注意的是，ABCA4连锁的Stargardt病的最新研究表明，虽然ABCA4在RPE中的表达水平仅为感光细胞水平的1％。因此，仅在RPE细胞中限制ABCA4的表达可部分挽救ABCA4-/-小鼠中的感光细胞变性（Lenis等，）。
这项研究提供了在视网膜疾病模型中使用RO的见解，因为它证明了与RP2丢失有关的表型是人类视网膜细胞培养模型所特有的，在动物模型中尚无报道。重要的是，缺乏RP2的类器官中的感光细胞死亡与杆状细胞成熟和视紫红质表达的时间有关。此外，我们强调了使用AAV恢复RP2表达的方式可以逆转此表型，因此可以进一步研究其作为XLRP治疗的潜在治疗途径。
方法
重新编程和基因编辑
使用从Addgene获得的无整合游离型载体，从两个无关的RX个体和对照成纤维细胞（BJ成纤维细胞（ATCC?CRL-?））生成iPSC：pCXLE-hOCT3/4-shp53-F（Addgene质粒），pCXLE-hSK（Addgene质粒）和pCXLE-hUL（Addgene质粒）（Okita等，），如先前所述（Schwarz等，）。将1×细胞与1μg每种质粒在μlNucleofector溶液中混合通过AmaxaNucleofectorI电穿孔之前（CellLineNucleofector试剂盒，Lonza）。RP2KOiPSC通过同时重编程和基因编辑，使用先前描述的方法（Howdenetal。，）进行生产，设计指导RNA靶向RP2的外显子2。（有关序列，请参见补充数据表S1），并根据先前描述的方案（Ran等，）克隆到pSpCas9（BB）-2A-Puro（PX）V2.0质粒（Addgene质粒）中。手动分离iPSC克隆，提取基因组DNA（Promega）和PCR用围绕靶位点设计的引物进行纯化（表S1）。通过Sanger测序分析iPSC克隆，以确认RP2基因的破坏。离谱仪（
