视网膜色素变性（Retinitispigmentosa）是一种进行性、遗传性、营养不良性退行性病变，发病率约为四千分之一，且最终会导致失明。迄今为止，已发现超过60个基因多于个突变与RP相关，因此为基因治疗增加了难度。年美国国立卫生研究院眼科研究所ZhijianWu博士团队在NatureCommunications杂志上公布了其研究成果，即通过AAV病毒载体直接向眼内输送基于CRISPR-Cas9的治疗元件，成功在视网膜变性小鼠中阻止了视网膜色素变性。
在视网膜的眼后部组织中有两种类型的细胞，能将光转换成电信号发给大脑，视杆光感受器能在昏暗的光线下产生视觉，而视锥光感受器则能在光照条件下实现色彩视觉。典型的RP患者最初表现为夜盲，视野逐渐缩小，但中心视力改变较少。随着视杆细胞进行性丢失，视锥细胞继发性死亡，从而出现视力下降并最终导致失明。
神经视网膜亮氨酸拉链（Nrl）在视网膜发育过程中决定了视杆细胞的命运，并且在维持视杆细胞功能中起着重要作用。年，华盛顿大学医学院神经病理学家Corbo教授的研究小组曾利用基于Cre的重组系统，发现敲减Nrl可以将视杆细胞转换为视锥样细胞（cone-likecells），并可在视网膜色素变性的小鼠中防止视杆细胞的死亡以及视锥细胞的继发性死亡。但这个方法并不能实际应用于临床。
于是ZhijianWu博士团队将目光转向了CRISPR-Cas9技术，将靶向Nrl的单导向RNA（sgRNA）和Cas9通过两个单独的腺相关病毒（AAV）载体，直接传递至小鼠视网膜上，作用于有丝分裂后期的感光细胞，进行Nrl的敲减。研究结果表明，视杆细胞中Nrl表达的缺失会导致其获得视锥样特征，并提高存活率，同时，该治疗方法在三种不同的视网膜变性小鼠模型中都显著提高了视杆细胞存活率及视锥细胞功能。从而表明，CRISPR/Cas9介导的视杆细胞NRL敲减有望在视网膜色素变性患者身上达到治疗效果。
PART-1
通过AAV-CRISPR/Cas9敲减小鼠光感受器上的EGFP基因
研究人员利用两个单独的AAV载体传递SpCas9和sgRNA，sgRNA载体中包含tdTomato以追踪转导，从而证实AAV-CRISPR/Cas9系统的光感受器特异性，且其持久表达不影响视网膜功能。同时使用增强的绿色荧光蛋白（EGFP）基因作为靶标评估AAV-CRISPR/Cas9的工作效率。最后得出约有43％的sgRNA转导的视杆细胞成功敲减了EGFP基因，其余57％未成功敲减的细胞可能是由于缺乏Cas9表达，框内插入缺失无法消除EGFP表达和/或小鼠中EGFP转基因的多个拷贝超过了CRISPR介导的基因敲除的能力。视网膜铺片和切片免疫荧光染色进一步验证了视杆中EGFP的敲减。
图片显示了经注射后的小鼠3个月大时视网膜铺片（左）和切片（右）。TdTomato表达（红色）表示AAV-sgRNA的转导。
PART-2
通过AAV-CRISPR/Cas9敲减小鼠光感受器上的Nrl基因
接下来，研究人员针对小鼠Nrl编码区选择了含NT2的sgRNA，将该载体包装到AAV8中并命名为AAV-sgRNA-Nrl。继而向2周龄野生型小鼠的一只眼睛视网膜下注射AAV-Cas9和AAV-sgRNA-Nrl（CRISPR-Nrl），向另一只眼注射同等剂量的AAV-Cas9和AAV-sgRNA-EGFP（CRISPR-EGFP）。注射后11至13周，SURVEYOR分析显示FACS富集tdTomato阳性细胞中形成插入缺失（4.1±0.6％），且进一步分析证明，选择合适的sgRNA后CRISPR组分的长期表达并不一定会增加脱靶风险。本实验中高通量测序分析和免疫荧光分析共同表明，在大多数CRISPR-Nrl转导的细胞中，两个Nrl等位基因均被敲减。
PART-3
Nrl基因敲减后视网膜的形态功能变化
与对照视网膜相比，接受CRISPR-Nrl的视网膜广泛显示核较大。特别是一些感光细胞核的异染色质区域较小，与典型的视杆细胞核不同，而与小鼠视锥细胞核相似。结果也表明，CRISPR-Nrl治疗不会显著改变整体视网膜结构。通过视网膜电图（ERG）监测小鼠的视网膜功能变化发现，在接受CRISPR-Nrl的眼睛中观察到了暗适应的a波和b波的幅度显著降低，表明视杆功能受损。但是，在明适应的b波振幅中未检测到明显变化，表明视锥功能相对稳定。
PART-4
Nrl敲减后视网膜光感受器基因表达的变化
Nrl通过促进视杆基因表达与CRX和其他转录因子协同作用而同时通过其靶NR2E3抑制视锥基因表达来维持视杆表型。尽管Nr1敲减后大多数视杆基因被下调，但是大多数显示减少不到两倍。除了Gnb3和Arr3发生了明显的上调外，大多数视锥细胞基因没有上调。免疫印迹分析检测到NR2E3，REEP6和NBN3的水平明显降低，免疫荧光研究表明，在用CRISPR-Nrl处理的视网膜中视紫红质，PDE6β和REEP6的表达略低，S-视蛋白，视锥蛋白和视锥磷酸二酯酶（PDE）的变化很小。
PART-5
三种不同小鼠模型中Nrl敲减后的变化
接下来研究人员使用三种不同的小鼠模型测试了CRISPR-Nrl治疗是否可以改变视杆特异性基因突变引起的视网膜变性过程。
Rho-/-小鼠Nrl敲减后
Rd10/Nrl-L-EGFP小鼠Nrl敲减后
RHOPS小鼠Nrl敲减后
研究人员使用了三种不同的小鼠模型表现不同病因和病理生理的视网膜变性：Rho-/-，RD10和RHO-PS。如大量存活的视杆细胞和相对完整的ONL所示，三个模型均对CRISPR-Nrl治疗反应良好。虽然研究并未显示敲减Nrl的视杆细胞是如何抵御致病突变的影响的，但非常清楚的是，ONL中甚至功能障碍或变形的视杆细胞也可以保护视锥细胞免于继发性死亡并保持视锥细胞介导的视力。总之，结果表明通过维持视杆细胞的存活可以预防或延迟视锥细胞的死亡。
本项研究的特别之处在于，以前的研究一般针对单一基因突变，而本文理论上可以针对绝大部分视杆细胞相关基因突变引起的视网膜色素变性；另外，以前的研究一般是在新生小鼠眼内注射质粒，通过electroporation传递基因，此时视网膜还未停止发育，一些细胞还会分裂分化；而本文是用以AAV为载体的CRISPR-Cas9系统，对接近成熟（2周）或成熟（4-5周）小鼠进行治疗，主要针对非分裂细胞。
总而言之，我们还需要更多的研究来证明该方法的可行性以及安全性。
原文：WenhanYu,SuddhasilMookherjee,VijenderChaitankaretal.NrlknockdownbyAAV-deliveredCRISPR/Cas9preventsretinaldegenerationinmice.NatureCommunications,Publishedonline:14March,doi:10./n
