HenriO.Leinonen教授，东芬兰大学维尔塔宁研究所神经生物学专业
简介芬兰人中出现的婴儿晚期神经元蜡样脂褐质储积症（CLN5）变体是神经元蜡样脂褐质储积（NCLs）疾病家族中的一种，是儿童中最为常见的神经退行性疾病（Savukoskiet.al.）。NCLs疾病最显著的病理特征是自体荧光蛋白等物质在溶酶体中聚集，但是这并不一定是导致神经退行性疾病的主要因素。在临床上，该疾病表现为视觉障碍，伴随运动和精神功能衰退、自发性癫痫发作，最终导致患儿过早的死亡。到目前为止，NCLs疾病没有有效的治疗方法，而且对该疾病的病理学发病机制也尚不明确。Leinonen教授科研团队认为构建CLN5小鼠视网膜表型模型可以很好的阐明该极具破坏性疾病的病理学发病机制，而且可以为临床前期药物试验提供一种有效的体内生物标记物。
试验方法◆小鼠模型的构建
有针对性的破坏小鼠CLN5基因的3号外显子（Kopraet.al.）。
◆视网膜电图（ERG）检测
分别进行常规和图形视网膜电图检测（PERG）（Ragauskas,Leinonenet.al.）。
◆运动机能检测
滚轮跑步机测试。
◆免疫组织化学实验检测
苏木素伊红染色（HE染色）用于对标本进行形态学分析。
应用GFAP、Iba1和CD45抗体进行免疫组织化学检测。
使用德国蔡司荧光显微镜光学分析系统对免疫荧光结果进行分析。
实验结果1.对运动功能和视网膜功能的评估。上侧图像显示实验结果按组平均的ERG信号波形信号强度为1.59logcd’s/m^2。右上角图表为滚筒式跑步机检测分析结果。左侧中央图像显示暗视ERGb波伴随上升。左下方图像显示暗视ERGa波跟随最强闪光强度上升。右侧中央图像显示明视ERG（20lux背景）b波在最强闪光强度时上升。右下方图像显示ERG对持续强度（60lux）的模式刺激（i.e.PERG,0.05CPD）的反应。可以发现在明视b波和模式ERG幅度的相互关系，尤其是在病变的视网膜组织中。
2.典型的HE染色图片显示了视网膜组织形态。RGC为视网膜神经节细胞，IPL为视网膜内网状层，INL为视网膜内核层，OPL视网膜外网状层，ONL为视网膜外核层，IS为视神经细胞内节，OS为视神经细胞外节，RPE为视网膜色素上皮。
3.视网膜感光受体（ONL）和内核层的厚度根据视网膜切片的HE染色标本进行测量。对视网膜六层厚度的测量依据视神经乳头（ONH）的大小作为校准点。
4.视网膜组织切片的免疫荧光图片原位杂交结果分别如下。5um厚度的组织切片与GFAP抗体结合激发绿色荧光，在星形胶质细胞和反应性穆勒神经胶质细胞中有表达。脂褐素被激发出很强的红色自体荧光，应用Iba1（绿色），CD45（红色）或GFAP（红色）进行复染。Iba1是稳定的小胶质细胞标记物，CD5则标记侵袭组织的白细胞。所以的切片最后都应用DAPI进行染核。利用Z-stack序列图合并所有数据构建3D图像。
实验结论◆CLN5小鼠创新性的展示了2个月内出现的视网膜视杆细胞退行性病变，尽管明视觉功能减退从第5个月才开始出现。
◆CLN5小鼠仍然表现出明显的星形胶质细胞和小胶质细胞活性、穆勒神经胶质增生和光感受器退行性改变，但是对其他组织的影响非常小。
◆Leinonen教授团队认为该研究方法是对NCL疾病的初步筛选方法，因为：1.视网膜退行性改变在很早即会出现，而且会不断加重，尽管运动障碍看起来从出生就存在。2.视网膜呈现出与大脑类似的组织病理学改变，但是其更容易发病。3.眼部症状的表现有很高的临床相关性，应该采取相应的治疗措施减缓视觉减退的速度。
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